Tutor 1

Aranguren Caro, Luis Fernando

Tutor 2

Caraballo, Xenia Margarita

Resumen

La Encefalopatía y retinopatía vírica, es una enfermedad viral, se caracteriza por anormalidades neurológicas, tales como la natación errática (en espiral, en remolino o con el vientre hacia arriba en posición de descanso), pérdida de apetito, letargia y la vacuolización de los tejidos nerviosos centrales, tiene una amplia distribución geográfica específicamente en climas tropicales y templados, esto afecta a más de cuarenta especies de peces marinos, causando daños económicos significativos a la industria acuícola. El objetivo del presente trabajo fue estandarizar un protocolo de RT-PCR para el diagnóstico de la Encefalopatía y Retinopatía Vírica, a partir de tejidos como retina, cerebro y contenido gonadal en diferentes estadios de la cobia (Rachycentron canadum) y reproductores de mero guasa . Se analizaron 11 pooles de 5 ejemplares de cobia (Rachycentron canadum), provenientes de CENIACUA y Antillanas C.I, además cuatro reproductores de mero guasa (Epinephelus itajara) provenientes del CEINER, donde se tomaron las muestras con base en comportamientos no propios de la especie, estas se homogenizaron de acuerdo a su estadio y tejido posteriormente conservándolas en RNAlater a -20°C, a excepción de los meros que se encontraban fijados en alcohol absoluto y se analizaron de forma individual. Se utilizó el Mini Kit RNeasy de Qiagen, para estandarizar el protocolo de extracción de ARN, mediante cebadores del gen β-actina, el cual fue utilizado como control interno para verificar la calidad de la extracción de los ácidos nucleicos, utilizando estos cebadores para la amplificación por medio de PCR se obtuvo un fragmento correspondiente a 422 pb (pares de bases), para cada una de las muestras a excepción del pool # 9, además se logró optimizar la temperatura de alineación por medio de un gradiente, obteniendo como resultado 61,4°C en la temperatura optima para el anillaje de los primers. El diagnóstico del virus se hizo mediante la estandarización de un protocolo de RT-PCR a partir de las secuencias reportadas en el Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI), donde se seleccionó una secuencia conservada del fragmento RNA1 (FJ789783.1), se diseñaron dos cebadores denominados F1 y F2 estas se amplificaron las muestras con una 17 temperatura de alineación a 55°C; en las muestras analizadas no se observo la presencia de una banda de amplificación que correspondiera con el peso molecular esperado , (F1) 322 pb y (F2) 340 pb, también se probaron otras secciones del fragmento RNA2 de la región T4 diseñados por Thiery et al.,(1999) propuestos por la OIE (2006) con una temperatura de anillaje a 58°C, en donde no se observó amplificación de los cebadores externos e internos de 420 pb y 292 pb respectivamente en las muestras analizadas, en los controles positivos se observo la presencia de la respectiva banda de amplificación, con estos datos se pudo determinar la ausencia del virus en las muestras analizadas, finalmente se implementó un protocolo de PCR anidada, con el fin de aumentar la especificidad y sensibilidad de la técnica usando los cebadores diseñados para la amplificación del fragmento RNA 1 y RNA 2. En conclusión se logró estandarizar el protocolo de RT-PCR para el VER con diferentes ensayos y ajustes en la temperatura de anillamiento para cada uno de los cebadores lo cual nos permitió realizar el screning de las poblaciones de peces en cultivos marinos y poder determinar la presencia del virus a partir de tejidos de retina, cerebro y contenido gonadal.

Resumen en lengua extranjera 1

Encephalopathy and viral retinopathy, is a viral disease, characterized by neurological abnormalities, such as erratic swimming (spiraling, swirling or belly up at rest), loss of appetite, lethargy and vacuolation of central nervous tissues, has a wide geographical distribution specifically in tropical and temperate climates, affects more than forty species of marine fish, causing significant aquaculture industry economic damage. The aim of this study was to standardize a protocol for RT-PCR for the diagnosis of encephalopathy and retinopathy viral, from tissues as retina, brain and gonadal content in different stages of cobia (Rachycentron canadum) and mero (Epinephelus itajara). 11 pools of 5 copies of cobia (Rachycentron canadum) from CENIACUA and Antillanas CI were analyzed, while four Goliath grouper (Epinephelus itajara) from the CEINER, where the samples were taken on the basis of no behaviors of the species, these were homogenized according to their stage and then keeping them in RNAlater tissue at -20 ° C, except mers were fixed in absolute ethanol and analyzed individually. The RNeasy mini kit from Qiagen was used to standardize the protocol for RNA extraction, using primers β-actin gene, which was used as an internal control to verify the quality of the extraction of nucleic acids, using these primers to the amplification by PCR corresponding to 422 bp (base pairs) fragment, for each of the samples except the pool # 9 further it was possible to optimize temperature of alignment by a gradient was obtained, resulting in 61 4 ° C the optimum temperature for the primers banding. Virus diagnosis was made by standardizing a protocol for RT-PCR from those reported in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) sequences, where a conserved sequence of RNA1 fragment (FJ789783.1) was selected, were designed two primers denominated F1 and F2 the samples were amplified with alignment to a temperature 55 ° C; in the tested samples the presence of an amplification band that corresponded to the expected molecular weight is not observed, (F1) 322 bp and (F2) 340 bp, other sections of RNA2 fragment of the T4 designed by Thiery were also tested et al., (1999) proposed by the OIE (2006) with a temperature of banding 19 at 58 ° C, where no amplification of external and internal primers 420 bp and 292 bp were observed respectively in the samples analyzed, the positive controls presence of a band of amplification was observed with these data could be determined in the absence of virus samples tested finally nested PCR protocol was implemented in order to increase the specificity and sensitivity of the technique using primers designed for amplification of RNA 1 and RNA 2 fragment. In conclusion it was possible to standardize the protocol RT-PCR for the SEE with different tests and adjustments in the annealing temperature for each primer allowed us to perform screning of fish stocks in marine culture and to determine the presence virus from tissues of retina, brain and gonadal content.

Palabras clave

Enfermedades bacterianas en animales, Laboratorios veterinarios, Enfermedades de peces, Piscicultura

Tipo de documento

Trabajo de grado - Pregrado

Licencia Creative Commons

Creative Commons Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 4.0 License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-Noncommercial-No Derivative Works 4.0 License.

Fecha de elaboración

2015

Programa académico

Zootecnia

Facultad

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Publisher

Universidad de La Salle. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Zootecnia

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